Как получают интерферон альфа 2b человеческий рекомбинантный

Posted by

Что такое интерферон альфа и его применять?


  • Лейкоцитарные и рекомбинантные препараты
  • Особенности и характеристики препаратов
  • При каких заболеваниях назначается?
  • Возможные побочные следствия, противопоказания

Иммунитет – это мощное оружие человека в борьбе с вирусными и бактериальными «вражескими» агентами извне.

Оглавление:

Не так давно, а именно в 1978 году, ученые обнаружили и утвердили фактор, который стимулирует иммунную систему, – интерфероны. Типов этих специфических белковых клеток открыто довольно много. Все интерфероны принято разделять на две группы, I и II. Наиболее используемый в медицинской практике интерферон альфа 2b, который относится к первой группе. Препараты на его основе показали великолепные результаты в борьбе с вирусами.

Эти белковые соединения вырабатываются клетками организма в ответ на вторжение «врага». Как только чужеродный элемент попадает в здоровую клетку и начинает в ней реплицировать, интерфероны активизируют защиту организма, что создает условия, в которых вирус не может размножаться. Следствие такой работы – гибель вирусных, бактериальных частиц.

Лейкоцитарные и рекомбинантные препараты

Интерферон альфа вырабатывается организмом самостоятельно, но в недостаточном количестве. Причины такой несостоятельности – плохая экология, наследственность и образ жизни. Именно поэтому после обнаружения клеток-защитников перед учеными возникла обязательная задача изготовления уникальных белков искусственным путем.

Сегодня в медицинской практике используются лекарственные средства с интерфероном, который получен либо биологическим, либо рекомбинантным путем. Первый способ производства базируется на выделении основного вещества из клеток донорской крови. Инструкция и упаковка препаратов с таким активным компонентом указывают его вид – человеческий лейкоцитарный. Альтернативный вариант промышленного производства – генно-инженерная технология, благодаря которой изготавливается рекомбинантный интерферон альфа 2b. Синтетический путь производства полностью исключает вероятность заражения какой-либо инфекцией, чего нельзя сказать об интерфероне лейкоцитарном: пусть теоретическая, но возможность заражения существует.



Особенности и характеристики препаратов

Интерферон альфа 2b после попадания в организм человека почти мгновенно запускает защитный механизм уничтожения вирусов и других патологических элементов. Он является координатором деятельности иммунной системы, регулирует ее работу. Процессы роста и размножения вирусов, ввиду такой деятельности вещества, прекращаются. Вражеский агент оказывается в условиях полной блокировки и неминуемо гибнет, так как исключается возможность захвата соседних здоровых клеток.

Кроме противовирусной активности, интерферон альфа 2b блокирует рост, распространение других атипичных клеток, в числе которых – раковые. Препараты с этим активным веществом приостанавливают или даже прекращают развитие онкологического процесса, подавляют активность факторов, приводящих к росту новообразований.

Интерферон альфа 2b обладает иммуномодулирующим свойством. Он стимулирует процесс образования антител, лимфокинов, активизирует фагоцитоз, что приводит к выведению антигенов из организма, укреплению иммунитета, повышению его устойчивости к инфекции.

При каких заболеваниях назначается?

Инструкция к препаратам интерферона альфа 2b указывает перечень заболеваний, при которых рекомендуется использование лекарственного средства. Среди них:

  • вирусные, бактериальные, смешанные инфекции,
  • септические заболевания различной этиологии,
  • острый, хронический гепатит В, хронический гепатит С,
  • герпетическая инфекция (лишай, генитальный герпес, кератоувеит),
  • меланомы, карциномы, саркома Капоши, лимфомы, волосатоклеточный лейкоз,
  • рак молочной железы, яичников, мочевого пузыря,
  • рассеянный склероз,
  • папилломатоз.

В терапевтической практике существует несколько вариантов введения препаратов интерферона: внутримышечно, внутривенно, подкожно и внутрикожно, ректально, интраназально и субконъюнктивально. Инъекции лекарственного средства обыкновенно осуществляются стационарно. Для домашнего использования чаще всего применяются растворы для закапывания, суппозитории, гели, мази.



Местное и ректальное применение практикуется для лечения и профилактики множества вирусных инфекций:

  • кожных поражений, поражений слизистых оболочек,
  • ОРВИ, гриппа,
  • бронхита, ларингита, пневмонии, других воспалений дыхательной системы,
  • инфекционных заболеваний у новорожденных, в раннем возрасте (обыкновенно используется лекарственная форма – суппозитории),
  • урогенитальных инфекций.

Интерферон альфа 2b назначается врачом. Способ введения препарата, дозировку, длительность курса также устанавливает специалист. Существует ошибочное мнение, что лекарственные препараты интерферона практически не имеют противопоказаний, так как их используют для лечения заболеваний новорожденных, детей раннего возраста. Мнение это ошибочно. Противопоказания и побочные неприятные эффекты у этого лекарственного средства есть. Вероятность развития последних довольно низка. Ведь искусственный интерферон – это ближайший родственник собственным белковым соединениям.

Возможные побочные следствия, противопоказания

В течение курса лечения некоторые пациенты могут отметить такие побочные эффекты:

  • гриппоподобные симптомы – лихорадка, «ломота», головная боль, потоотделение,
  • со стороны органов пищеварения – сниженный аппетит, тошнота, рвота, боль в животе,
  • со стороны нервной системы – нарушение сна, депрессия, головокружение, нервозность, агрессивность, тремор, невропатия,
  • со стороны сердечно-сосудистой системы – тахикардия, нарушение артериального давления, ИБС, инфаркт миокарда,
  • кожные реакции – сыпь, сильный зуд, выпадение волос,
  • аллергия,
  • другие индивидуальные реакции.

Ввиду вышеперечисленных возможных побочных эффектов, интерферон альфа 2b не назначается при тяжелых патологиях сердечно-сосудистой системы, печеночной и почечной недостаточности, эпилепсии и других заболеваниях ЦНС, при депрессиях, сахарном диабете, аутоиммунных заболеваниях, беременности, лактации.

Цена хорошего лекарственного средства обыкновенно больно ударяет по семейному бюджету. Чего нельзя сказать о препаратах с интерферонами, средняя цена которых находится в районе 500 рублей. Здоровье либо бесценно, либо не должно стоить болезненно дорого. Лучшим и бесплатным средством лечения и профилактики является собственный иммунитет. Интерферон – один из оптимальных и недорогих способов его активизации.



Источник: http://papillomnet.ru/lekarstva/interferon-alfa-2b.html

способ получения рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2b, рекомбинантная плазмида и штамм продуцент для его осуществления

A61K38/19 цитокины; лимфокины; интерфероны

Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии, медицине, фармакологии. Новая рекомбинантная мультикопийная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека, экспрессия которого находится под контролем лактозного и триптофанового промоторов и терминатора транскрипции. В результате трансформации клеток реципиентного штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидной ДНК pSX50 получен штамм Е. coli SX50 — продуцент рекомбинантного лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека с продуктивностью до 0.9-1.0 г альфа-2b интерферона с 1 л культуральной среды. Способ получения рекомбинантного альфа-2b интерферона основан на использовании созданного рекомбинантного штамма Е. coli SX50 и предусматривающий его глубинное культивирование на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при высоком давлении, растворение агрегированного белка в концентрированном растворе гуанидин гидрохлорида с последующей ренатурацией интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов и его очисткой с использованием трехстадийной хроматографической очистки интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow иммобилизованной ионами Cu +2 , ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа СМ Sephsrose Fast Flow и гель фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75. Способ позволяет получать субстанцию интерферона более 99% чистоты по данным электрофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром и более 98% по данным RF HPLC и не содержащую пирогенов (LAL-тест) в количествах не менеемг с 1 л культуральной среды. 3 н. и 3 з.п ф-лы, 6 ил.

Рисунки к патенту РФ

Изобретение относится к генно-инженерным лекарственным препаратам, получаемым биотехнологическим путем, а именно к способам промышленного получения рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b человека медицинского назначения (далее интерферон), а также к рекомбинантньм штаммам продуцентам Escherichia coli (E.coli) и плазмидным ДНК, кодирующим синтез интерферона.

Интерфероны представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой отдодальтон, продуцируемые и секретируемые клетками в ответ на вирусную инфекцию или другие возбудители. Выделяют три основные группы интерферонов: альфа, бета и гамма. Сами по себе эти группы не являются однородными и могут содержать несколько различных молекулярных разновидностей интерферона. Так, выделено более 14 генетических разновидностей интерферона альфа, которые представляют интерес и находят широкое применение в медицине в качестве противовирусных, антипролиферативных и иммуномодулирующих средств.



Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами (SU, RU, RU).

Основным недостатком этих способов получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др.

В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. //High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),, 1995), является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза. Недостатком использования штаммов Ps. putida (SU, SU, SU, RU, RU) является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli (Semin. Oncol.,1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9):S9-41-S9-51).



Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.

Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp , и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.

Экспрессия интерферона штаммом E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac , Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии (RU).

Недостатком способа является низкая технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона. Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда "течет". Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате — снижение выхода интерферона.

Задачей данного изобретения является конструирование рекомбинантого промышленного штамма продуцента Е. coli с помощью новой рекомбинантной плазмидной ДНК, обладающего высоким уровнем биосинтеза интерферона, и разработка эффективной промышленной технологии получения субстанции интерферона медицинского назначения, соответствующей по качеству "European Pharmacopoeia " для субстанции интерферона альфа-2b.

Указанная задача решалась созданием рекомбинантной плазмидной ДНК pSX50 и штамма Escherichia coli SX50, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных штаммов ФГУП ГосНИИ генетики, номер ВКПМ В-8550,

а также способом получения рекомбинантного альфа-2b интерферона, основанным на использовании рекомбинантного штамма Е. coli SX50 и предусматривающим его глубинное культивирование на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при высоком давлении, растворение агрегированного белка в концентрированном растворе гуанидин гидрохлорида с последующей ренатурацией интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов и трехстадийной хроматографической очисткой интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованной ионами Сu +2 , ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа CM Sepharose Fast Flow и гель фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75.

Согласно изобретению предлагается новая рекомбинантная мультикопийная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека, экспрессия которого находится под контролем лактозного и триптофанового промоторов и терминатора транскрипции. Плазмида pSX50 имеет 3218 пар оснований (п.о.) и характеризуется наличием следующих фрагментов:

— Последовательность с 1 нуклеотида по 176 нуклеотид (н.) включает фрагмент ДНК размером 176 п.о., содержащий триптофановый промотор (Ptrp);

— Последовательность с 177 н. по 194 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий последовательность Шайн Дельгарно, ответственный за инициацию трансляции;

— Последовательность с 195 н. по 695 н. включает фрагмент ДНК размером 501 п.о., содержащий последовательность гена интерферона со следующими нуклеотидными заменами: в положении 37 замена А на С, в положении 39 замена G на Т, в положении 40 замена А на С, в положении 42 замена G на Т, в положении 67 замена А на С, в положении 69 замена G на Т, в положении 70 замена А на С, в положении 72 замена А на Т, в положении 96 замена G на А, в положении 100 замена А на С, в положении 102 замена А на Т, в положении 114 замена А на С, в положении 120 замена С на G, в положении 126 замена G на А, в положении 129 замена G на А, в положении 330 замена С на G, в положении 339 замена G на А, в положении 342 замена G на А, в положении 487 замена А на С, в положении 489 замена А на Т, в положении 495 замена G на А;



— Последовательность с 696 н. по 713 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий синтетический полилинкер;

— Последовательность с 714 н. по 1138 н. включает фрагмент ДНК плазмиды рКК223-3 с 4129 н. по 4553 н. размером 425 п.о., содержащий последовательность строгого терминатора транскрипции rrnBT1T2 ;

— Последовательность с 1139 н. по 1229 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 2487 н. по 2577 н. размером 91 п.о., содержащий промотор гена -лактомазы (ген устойчивости к ампициллину — Аmр R );

— Последовательность с 1230 н. по 2045 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC4K с 720 н. по 1535 н. размером 816 п.о., содержащий структурную область гена kan;

— Последовательность с 2046 н. по 3218 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 1625 по 453 н. размером 1173 п.н., содержащий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды (ori) и lac промотора (Plac ).



На фиг.1-5 изображены схемы конструирования и физическая карта плазмиды рSХ50.

На фиг.6 представлена установленная для плазмиды pSX50 полная последовательность нуклеотидов.

Штамм Escherichia coli SX50 получен трансформацией клеток Escherichia coli BL21 плазмидой pSX50 с использованием традиционной генно-инженерной технологии. Штамм E.Coli SX50 характеризуется следующими признаками.

Клетки мелкие, прямые, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" образуются круглые, гладкие, выпуклые, мутные, блестящие, серые колонии, с ровными краями. При росте в жидких средах (в минимальной среде с глюкозой или в LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Аэроб. Температурный диапазон роста 4-42°С при оптимуме рН 6,5-7,5.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, так и органические соединения в виде аминокислот, пептона, триптона, дрожжевого экстракта и т.д.



В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы. Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к канамицину (до 100 мкг/мл).

Штамм Escherichia coli 8Х50 — продуцент интерферона.

Способ, условия и состав среды для хранения штамма

В L-arape с добавлением канамицина до концентрации 20 мкг/мл под маслом, в L-бульоне, содержащем 15% глицерина и соответствующими антибиотиками в ампулах при температуре минус 70°С, в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре плюс 4°С.

Штамм Escherichia coli SX50 идентифицирован по Определителю Берги (1974) как штамм вида Escherichia coli.

Способ промышленного получения альфа-2b интерферона



Особенностью заявляемого способа является разработка технологии, позволяющая выделять интерферон из нерастворимой формы, накапливающейся в течение ферментации, что позволяет существенно упростить технологическую схему процесса выделения и повысить выход целевого продукта.

Способ заключается в культивировании штамма Escherichia coli SХ50 в питательной среде, с постоянным добавлением питательных субстратов, предпочтительно глюкозы и дрожжевого экстракта, в процессе биосинтеза, предпочтительно с пониженным содержанием триптофана, механическом разрушении клеток микроорганизма при высоком давленииbar, растворении интерферона в буферном растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов, с последующей трехстадийной хроматографической очистке интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованных ионами Сu +2 , ионообменную хроматографию на ионообменных смолах типа CM Sepharose Fast Flow и гель фильтрационную хроматографию на смолах типа Superdex 75.

Оптимальными условиями проведения отдельных стадий получения интерферона являются следующие:

— ферментацию проводят при непрерывном добавлении субстратов в течение всего процесса, что обуславливает высокий уровень экспрессии интерферона;

— разрушение клеток осуществляют в дезинтеграторе типа Гаулин при давлении 900 bar;



— удаление растворимых клеточных компонентов (ДНК, РНК, белков, липополисахаридов и т.д.) производят промыванием нерастворимой формы интерферона буферными растворами, содержащими детергенты (Тритон XI00, мочевина и т.д.);

— образовавшийся осадок, содержащий интерферон, растворяют в буферном растворе 6 М гуанидина гидрохлорида;

— ренатурацию интерферона проводят в физиологическом буферном растворе, содержащем хаотропные агенты;

— трехстадийную хроматографическую очистку интерферона проводят на Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованной ионами Сu +2 , на катионообменной смоле СМ Sepharose Fast Flow и гель фильтрационную хроматографию на смоле типа Superdex 75;

— после каждой хроматографической очистки проводят стерилизующую фильтрацию через апирогенные фильтры с размерами пор 0.22 мкм.



Выход интерферона в результате применения описанного способа составляет примерномг интерферона с 1 л культуральной среды. Качество получаемого продукта соответствует нормам и требованиям "European Pharmacopoeia" для субстанции альфа-2b интерферона.

Существенными отличиями заявляемого способа от прототипа являются:

— использование конструкции штамма, с более высокой производительностью, что позволяет получать при биосинтезе большее количество интерферона с 1 л культуральной среды;

— использование эффективного механического разрушения клеточной биомассы, что позволяет получать более чистый экстракт нерастворимой формы интерферона за более короткое время, с меньшими потерями;

— использование физиологических буферных растворов при ренатурации в присутствии хаотропных агентов позволяет повысить выход корректно ренатурированной формы интерферона;



— трехстадийная хроматографическая очистка интерферона позволяет получать субстанцию интерферона более 99% чистоты по данным электрофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром и более 98% по данным RF HPLC и практически не содержащую пирогенов (LAL-тест).

Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды рSХ50

Способ конструирования плазмиды pSX50 включает следующие этапы:

— конструирование векторной плазмиды pSX10;



1. конструирование плазмиды pSX3 (2641 п.о.)

2. конструирование векторной плазмиды pSX10 (2553 п.о.)

— конструирование рекомбинантной плазмиды pSX41 (3218 п.о.);

— конструирование рекомбинантной плазмиды pSX43 (3218 п.о.);

— конструирование рекомбинантной плазмиды pSX45 (3218 п.о.);



— конструирование рекомбинантной плазмиды pSX50 (3218 п.о.).

Конструирование векторной плазмиды pSX10

Векторная плазмида pSX10 представляет собой вектор pUC19, в котором кодирующая последовательность гена бета лактомазы, обеспечивающая устойчивость к ампициллину, заменяется кодирующей последовательностью гена kаn и содержит терминатор транскрипции из плазмиды рКК223-3.

Конструирование векторной плазмиды pSS10 проводят в две стадии:

— получение плазмиды pSX3 (2641 п.о.), представляющей собой плазмиду pUC19, в которой кодирующая область аmp гена заменяется на кодирующую область гена kan;



— получение веторной плазмиды pSX10 (2553 п.о.), представляющей собой плазмиду pSX3, в которой за BamHI сайтом вставлен фрагмент ДНК, кодирующий терминатор транскрипции ггBT 1T2.

Для получения плазмиды pSX3 проводят пять раундов амплификации ДНК методом ПЦР (полимеразная цепная реакция). В ходе первого раунда, используя ДНК плазмиды pUC19 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 1828 п.о. (фрагмент PU1-PU2) с помощью праймеров:

Данную и последующие ПЦР реакции проводят в следующих условиях: 20 mМ Tis-HCl, рН 8.8, 10 mM (NH4)2 SO4,10 mМ КСl, 2 тМ MgCl2, 0.1% Triton Х100,0.1 mg/ml BSA, 0.2 mM каждого dNTP, 1.25 ед. Pfu ДНК полимеразы, 100 нг ДНК. Процесс амплификации состоит из следующих стадий: прогревание при 95°С 5 мин, 35 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 2 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. После амплификации (и после последующих амплификаций) фрагмент ДНК очищают электрофоретически в 1% агарозном геле. В ходе второго и третьего раундов, используя ДНК плазмиды pUC4K в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 555 п.о. (фрагмент КМ1-КМ2) с помощью праймеров:

и амплификацию фрагмента ДНК размером 258 п.о. (КМЗ-КМ4) с праймеров

Далее фрагменты (КМ1-КМ2) и (КМ3-КМ4) объединяют в четвертом раунде амплификации, используя праймеры КМ1 и КМ4, получают фрагмент ДНК размером 813 п.о. (КМ1-КМ4), кодирующий структурную часть гена kan.

В пятом раунде ПЦР проводят объединение фрагментов (PU1-PU2) и (КМ1-КМ4) в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 5 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. ДНК, полученную после последней ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. В результате получают плазмиду рSХ3 размером 2641 п.о.



Для получения векторной плазмиды pSX10 проводят три раунда амплификации ДНК методом ПЦР. В ходе первого раунда, используя ДНК плазмиды pSX3 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 2025 п.о. (фрагмент 10.1-10.2) с помощью праймеров:

В ходе второго раунда, используя ДНК плазмиды рКК223-3 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 528 п.о. (фрагмент КК1-КК2) с помощью праймеров:

В третьем раунде ПЦР проводят объединение фрагментов (10.1-10.2) и (КК1-КК2) в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 5 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. ДНК, полученную после последней ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. В результате получают плазмиду pSX10 размером 2553 п.о.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX41

— Рекомбинантная плазмида pSX41 представляет собой Hind III — BamHI фрагмент ДНК векторной плазмиды pSX3 (2529 п.о.), Hind III — EcoRI фрагмент ДНК размером 168 п.о., кодирующий промотор триптофанового оперона Е. coli (Ptrp), EcoRI-XbaI синтетический фрагмент ДНК размером 20 п.о., кодирующий SD последовательность (Шайн-Дельгарно) и XbaI-BamHI фрагмент ДНК размером 501 п.о., кодирующий ген альфа 2b интеферона человека.



Для получения Hind III — ВаmHI фрагмент ДНК векторной плазмиды pSX3 (2529 п.о.) ДНК плазмиды pSX3 обрабатывают ферментами рестрикции HindIII и BamHI с последующей электрофоретической очисткой в 1% агарозном геле. Hind III EcoRI фрагмент ДНК размером 168 п.о., кодирующий промотор триптофанового оперона (Ptrp) получают методом ПЦР, используя тотальную ДНК Е. coli в качестве матрицы и праймеры TRP1 и PRP2 с последующей обработкой амплифицированного фрагмента рестриктазами Hindlll и EcoRI:

Для получения EcoRI-Xbal синтетический фрагмент ДНК размером 20 п.о., кодирующий SD последовательность (Шайн-Дельгарно), синтезируются следующие комплементарные олигонуклеотиды:

XbaI-ВаmIII фрагмент ДНК размером 501 п.о., кодирующий ген альфа 2b интеферона человека, получают методом ПЦР, используя тотальную ДНК человека в качестве матрицы и праймеры IFN1 и IFN2 с последующей обработкой амплифицированного фрагмента рестриктазами Xbal и ВаmIII:

Далее электрофоретически очищенные фрагменты объединяют, лигируют ферментом лигаза фага Т4, ДНК трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX41 размером 3218 п.о. Далее проводят поэтапный мутагенез гена интерферона для увеличения уровня экспрессии целевого продукта. Мутагенез гена интерферона заключается в замене редко встречающихся в Е. coli триплетов, кодирующих соответствующие аминокислоты на часто встречающиеся в Е. coli триплеты, кодирующие эти же аминокислоты. Мутагенез ДНК гена интерферона проводят методом ПЦР.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX43



Для получения рекомбинантной плазмиды pSX43 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПЦР, используя ДНК плазмиды pSX41 в качестве матрицы и праймеры IFN3 и IFN4:

ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду рSХ43 размером 3218 п.о.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX45

Для получения рекомбинантной плазмиды pSX45 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПЦР, используя ДНК плазмиды pSX43 в качестве матрицы и праймеры IFN5 и IFN6:

ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX45 размером 3218 п.о.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX50.

Для получения рекомбинантной плазмиды pSX50 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПЦР, используя ДНК плазмиды pSX45 в качестве матрицы и праймеры IFN7 и IFN8:

ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX50 размером 3218 п.о.

Пример 2. Получение штамма Е. coli SX50 — продуцента интерферона

Штамм продуцент интерферона Е. coli SX50 получают путем трансформации клеток штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидой рSХ50. Штамм продуцент интерферона выращивают в 30 л ферментере до оптической плотности 25.0-30.0 о.е. в среде М9, содержащей 1% кислотного гидролизата казеина (Difco), 1% глюкозы, 40 мкг/мл канамицина, при температуре 38-39°С. В процессе ферментации проводят непрерывное добавление питательного субстрата, используя гравитометрический контроллер.

Содержание интерферона в биомассе клеток, получаемые с 1 л культуры, составляет в зависимости от серии 0.9-1.0 г интерферона.

Пример 3. Способ выделения интерферона из штамма Е. coli SX50

Получение интерферона проводили в 4 этапа:

1 этап. Культивирование штамма Е. coli SX50.

2 этап. Выделение и очистка нерастворимой формы интерферона.

3 этап. Растворение и ренатурация интерферона.

4 этап. Хроматографическая очистка интерферона.

1 этап. Культивирование штамма Е. coli SX50

Выращенный посевной материал штамма Е. coli SX50 в объеме 3 л богатой среде LB в течение 12 ч при 26°С асептически вносят в ферментер, содержащий 27 л стерильной среды, содержащей М9, 1% кислотного гидролизата казеина, 1% глюкозы, 1 мМ MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 40 мг/мл канамицина. Культивирование в ферментере проводят при температуре 38-39°С, поддерживая рН 7±0,15 путем автоматической подтитровки 40%-ным раствором гидроокиси натрия. Концентрацию растворенного кислорода в диапазоне (50±10)% от насыщения поддерживают путем изменения скорости оборотов мешалки от 100 до 800 об/мин и подачи воздуха от 1 до 15 л/мин. Концентрацию субстратов, в частности глюкозы и дрожжевого экстракта, измеряют в течение ферментации и поддерживают их концентрацию путем изменения скорости подачи концентрированных растворов, через перистальтические насосы, используя гравиметрический контроллер.

Накопление интерферона в виде нерастворимой формы контролируют с помощью фазово-контрастной микроскопии, методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле (SDS-PAAG) и методом обратнофазной высокоэффективной хроматографии (RF HPLC). Ферментацию останавливают по достижении максимальной оптической плотности (

25-30 о.е.) и остановки синтеза интерферона. По окончании ферментации культуральную жидкость сепарируют центрифугированием в проточном роторе при скорости вращения0 об/мин. Биомассу фасуют в полиэтиленовые пакеты и замораживают при температуре минус 70°С.

2 этап. Выделение и очистка нерастворимой формы интерферона

г замороженной биомассы штамма Е. coli SX50 суспедируют в 3000 мл буфера 1 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Triton X100). Суспензию пропускают через проточный гомогенизатор типа Гаулин, поддерживают давление 900 бар и центрифугируют в проточном роторе приоб/мин. Полученный осадок промывают в аналогичных условиях последовательно буферами 2 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 мМ ЭДТА, 3 М мочевины) и буфером 3 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 1 мМ ЭДТА) и окончательно осадок интерферона суспедируют в 200 мл буфера 3. При этом время выделения и очистки нерастворимой формы интерферона составляет не более 5 час.

3 этап. Растворение и ренатурация интерферона

К полученной на предыдущем этапе суспензии нерастворимой формы интерферона добавляют сухой гуанидин гидрохлорид до концентрации 6 М, добавляют дитиотреитол до концентрации 50 мМ, Tris-HCl pH 8.0 до концентрации 50 мМ, NaCl до концентрации 150 мМ и Triton X100 до концентрации 0.1%, инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Нерастворившийся материал отделяют при стерилизующей фильтрации через мембраны с диаметрами пор 0.22 микрона.

Ренатурацию интерферона проводят путем медленного разбавления полученного раствора враз буфером 4 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 мМ NaCl, 0.1 мМ ЕДТА). После чего ренатурационную смесь инкубируют при постоянном перемешивании в течениечас при температуре 4-8°С. Далее добавляют сульфат магния до концентрации 1 мМ и агрегированный материал удаляют стерилизующей фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0.22 микрона.

4 этап. Хроматографическая очистка интерферона

Хроматографическую очистку интерферона осуществляют в три стадии.

1. Полученный ренатурированный интерферон на первом этапе подвергают очистке с помощью аффинной хроматографии на смоле типа Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences), иммобилизованной ионами Cu +2 . Для этого раствор интерферона наносят на колонну с Cu +2 Chelating Sepharose Fast Flow и интерферон элюируют буфером 0.1 М лимонной кислоты pH 2.2.

2. На второй стадии хроматографической очистки раствор интерферона наносят на катионообменную смолу типа CM Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) и интерферон элюируют градиентом растворов (0.0-0.5 М NaCl) в буфере 50 мМ Nа(СН3СОО), рН 5.5.

3. Очистка мономерной формы интерферона от остатков полимерных форм интерферона проводят на третьей стадии очистки интерферона гель-фильтрацией на смоле типа Superdex 75 (Amersham Biosciences). Хроматографию проводят в буфере 50 мМ Na(CH3COO), рН 5.0, содержащем 0.15М NaCl.

Описанный способ выделения и очистки интерферона позволяет получить 4-8 г высокоочищенного интерферона за один цикл выделения в течение 7-10 дней из биомассы, полученной с 10 л культуральной среды. Качество получаемого интерферона в полной мере соответствует требованиям "European Pharmacopoeia" для субстанции интерферона альфа-2b, а именно:

— Концентрация интерферона не менее 2×10 8 МЕ/мл;

— Удельная активность интерферона не менее 2.0×10 8 МЕ/мг;

— Электофоретическая чистота препарата не менее 99% в редуцирующих и не редуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром;

— Содержание правильно ренатурированной формы интерферона не менее 98% по данным RF HPLC;

— Изоэлектрическая точка выделенного интерферона находится в районе рН 5.8-6.3;

— Пептидная карта выделенного интерферона принципиально не отличается от пептидной карты для Европейского стандарта интерферона альфа 2b CRS;

— Содержание бактериальных эндотоксинов не более 100 ME на 1 мг интерферона.

Как следует из приведенных примеров, заявляемая группа изобретений позволяет получать интерферон альфа-2b с высоким выходом при относительно простой и надежной технологии.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона, характеризующаяся тем, что она имеет размер 3218 пар оснований (п.о.) и состоит из следующих фрагментов: последовательность с 1 по 176 нуклеотида (н.) включает фрагмент ДНК размером 176 п.о., содержащий триптофановый промотор (Рtrp), последовательность с 177 по 194 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий последовательность Шайн Дельгарно, ответственный за инициацию трансляции, последовательность с 195 по 695 н. включает фрагмент ДНК размером 501 п.о., содержащий ген интерферона альфа-2b с нуклеотидными заменами: 37 (А>С), 39 (G>T), 40 (А>С), 42 (G>T), 67 (А>С), 69 (G>T), 70 (А>С), 72 (А>Т), 96 (G>A), 100 (А>С), 102 (А>Т), 114 (А>С), 120 (C>G),126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A>C), 489 (А>Т), 495 (G>A), последовательность с 696 по 713 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий синтетический полилинкер, последовательность с 714 по 1138 н. включает фрагмент ДНК плазмиды рКК223-3 с 4129 по 4553 н. размером 425 п.о., содержащий последовательность строгого терминатора транскрипции rrnBT1T2, последовательность с 1139 по 1229 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 2487 по 2577 н. размером 91 п.о., содержащий промотор гена -лактомазы (ген устойчивости к ампициллину -Amp R ), последовательность с 1230 по 2045 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC4K с 720 н. по 1535 н. размером 816 п.о., содержащий структурную область гена kan, последовательность с 2046 н. по 3218 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 1625 по 453 н. размером 1173 п.н., содержащий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды (ori) и lac промотора (Plac).

2. Штамм бактерий Eschcerichia coli SX50 трансформированный рекомбинантной плазмидой по п.1 — продуцент рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b человека.

3. Способ получения интерферона альфа-2b человека, включающий культивирование штамма Escherichia coli SX5 по п.2 в питательной среде с постоянным добавлением питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при давленииbar, растворение интерферона в буферном растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурацию интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов, трехстадийную хроматографическую очистку интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованных ионами Сu +2 , ионообменную хроматографию на ионообменных смолах типа CM Sepharose Fast Flow и гель-фильтрационную хроматографию на смолах типа Superdex 75.

4. Способ по п.3, в котором культивирование проводят на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов, предпочтительно глюкозы и дрожжевого экстракта.

5. Способ по п.3, в котором перед растворением интерферона его очищают удалением растворимых клеточных компонентов, включающих ДНК, РНК, белки, липополисахариды, промыванием буферными растворами, содержащими детергенты типа Тритон XI 00, мочевин.

6. Способ по п.3, в котором после каждой хроматографической очистки проводят стерилизующую фильтрацию через фильтры с размерами пор 0.22 мкм.

Источник: http://www.freepatent.ru/patents/

Здоровье детей

Может кто знает как готовят Виферон?

Вообще, поиск рулит. Но отвечу подробно, чтобы можно было распечатать и принести врачу. Вдруг это поможет?

Я думаю, что это несоответствие — достаточно интересный вопрос, чтобы задать его тому врачу, который назначил Виферон.

ERRARE HUMANUM EST, SED DIABOLICUM PERSEVERARE…..

Совершение ошибок свойственно человеку,

дьявол же упорствует в заблуждени.

2).при чисто бактериальных инфекциях эффекта и правда нет,но при смешанных и вирусных-очень даже есть,по-видимому у нас разные источники информации

3).основные побочные эффекты связаны с применением ВЫСОКИХ доз препарата(свыше 3 млн)и ИНЪЕКЦИОННО в суппозиториях же макс доза 3 млн.

ERRARE HUMANUM EST, SED DIABOLICUM PERSEVERARE…..

Совершение ошибок свойственно человеку,

дьявол же упорствует в заблуждени.

принимаю на веру только печатные версии авторитетных издательств,желательно свежие.

1.Значит по вашему кровь после ретального введения не проходит через печень?

2.Приведённые исследования показывают как раз неэффективность интерферона при острых респрираторных и острых кишечных инфекциях (вирусных или бактериальных) в любом виде.

3.Следуя вашей же логике,если введение меньших доз препарата имеют аналогичное действие с введением больших доз парентерально,то и побочные действия должны быть при меньших концентрациях.

ERRARE HUMANUM EST, SED DIABOLICUM PERSEVERARE…..

Совершение ошибок свойственно человеку,

дьявол же упорствует в заблуждени.

1. кровь проходит через печень в любом случае,имеет значение когда-до того как ЛС попало в общий кровоток(при пероральном применении) либо после(при ректальном,сублингвальном,парентеральном)

2. еще раз повторю-есть данные доказывающие эффективность при ВИРУСНЫХ инфекциях. и если Вы их не нашли,то не значит,что это не так

3.я не утверждала,что действие разных доз аналогично,при разных заболеваниях применяются разные дозы и нет необходимости применять высокие при ОРВИ.

если Вы знакомы с фармакологией,то понятие "широта терапевтического действия" объясняет связь между дозой и побочными эффектами.

Основные побочки связаны именно со способом введения препарата(часто реакции могут быть и не на само действующее в-во,а на консерванты,буферы и пр.)

ERRARE HUMANUM EST, SED DIABOLICUM PERSEVERARE…..

Источник: http://www.uaua.info/mamforum_arch/theme/385448.html

Инструкция по применению лекарств, аналоги, отзывы

Инструкция от таблетки.рф

Главное меню

Только самые актуальные официальные инструкции по применению лекарственных средств! Инструкции к лекарствам на нашем сайте публикуются в неизменном виде, в котором они и прилагаются к препаратам.

Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ РЕЦЕПТУРНОГО ОТПУСКА НАЗНАЧАЮТСЯ ПАЦИЕНТУ ТОЛЬКО ВРАЧОМ. ДАННАЯ ИНСТРУКЦИЯ ТОЛЬКО ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ РАБОТНИКОВ.

Описание действующего вещества Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный/ Interferonum alpha-2b.

Формула, химическое название: нет данных.

Фармакологическая группа: иммунотропные средства/ иммуномодуляторы/ интерфероны; противоопухолевые средства/ другие противоопухолевые средства; противомикробные, противопаразитарные и противоглистные средства/ противовирусные средства/ противовирусные (за исключением ВИЧ) средства.

Фармакологическое действие: иммуномодулирующее, противоопухолевое, противовирусное, антипролиферативное.

Фармакологические свойства

Препарат синтезируется бактериальными клетками штамма Escherichia coli SG-20050/pIF16, в генетический аппарат которых встроен ген человеческого интерферона альфа-2b. Препарат представляет собой белок, который содержит 165 аминокислот, он идентичен по свойствам и характеристикам лейкоцитарному интерферону альфа-2b человека. Противовирусное действие проявляется во время репродукции вируса, происходит активное включение препарата в метаболические процессы клеток. Реагируя со специфическими рецепторами на поверхности клеток, препарат инициирует ряд внутриклеточных изменений, в том числе продукцию специфических ферментов (протеинкиназы и 2-5-аденилатсинтетазы) и цитокинов, действие которых замедляет синтез рибонуклеиновой кислоты вируса в клетке и вирусного белка. Повышает фагоцитарную активность макрофагов, усиливает специфическое цитотоксическое действие лимфоцитов на клетки-мишени. Изменяет функциональную активность иммунокомпетентных клеток, качественный и количественный состав декретируемых цитокинов, образование и секрецию внутриклеточных белков. Подавляет пролиферацию опухолевых клеток и образование некоторых онкогенов, что угнетает опухолевый рост.

Максимальная концентрация препарата при парентеральном введении достигается через 2 — 4 часа. Через 20 — 24 часа после введения препарат в плазме крови не определяется. Концентрация препарата в сыворотке крови на прямую зависит от кратности и дозы введения. Метаболизируется в печени, выводится, главным образом, через почки, частично в неизмененном виде.

Показания

Терапия и профилактика гриппа и острых респираторно-вирусных инфекций; экстренная профилактика клещевого энцефалита вместе с противоклещевым иммуноглобулином; атопические заболевания, аллергический риноконъюнктивит, бронхиальная астма при проведении специфической иммунотерапии.

Комплексное лечение у взрослых: острый вирусный гепатит В (среднетяжелые и тяжелые формы в начале желтушного периода до пятого дня желтухи (в поздние сроки препарат менее эффективен; при холестатическом течении заболевания и развивающейся печеночной коме препарат не эффективен); острый затяжной гепатит В и С, хронический активный гепатит В и С, хронический гепатит В с дельта агентом; волосатоклеточный лейкоз, рак почки IV стадии, злокачественные лимфомы кожи (первичный ретикулез, грибовидный микоз, ретикулосаркоматоз), базальноклеточный и плоскоклеточный рак кишки, саркома Капоши, сублейкемический миелоз, кератоакантома, гистиоцитоз из клеток Лангерганса, хронический миелолейкоз, эссенциальная тромбоцитемия; вирусные конъюнктивиты, кератиты, кератоконъюнктивиты, кератоувеиты, кератоиридоциклиты; урогенитальная хламидийная инфекция; лихорадочная и менингеальная форма клещевого энцефалита.

Комплексное лечение у детей от 1 года: респираторный папилломатоз гортани, начиная со следующего дня после удаления папиллом; острый лимфобластный лейкоз в периоде ремиссии после окончания индукционной химиотерапии (на 4-5 месяце ремиссии).

Способ применения интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного и дозы

Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный вводится внутримышечно, подкожно, в очаг поражения, субконъюнктивально, принимается внутрь, используется местно. Способ применения, дозы, режим и длительность лечения устанавливаются индивидуально в зависимости от показаний, возраста, состояния пациента, переносимости препарата.

Во время лечения общие клинические анализы крови необходимо проводить каждые 2 недели, биохимические — каждые 4 недели. При снижении абсолютного числа нейтрофилов менее 0,50 Х 10^9/л, а числа тромбоцитов менее 25 Х 10^9/л, терапию следует отменить. При снижении абсолютного числа нейтрофилов менее 0,75 Х 10^9/л, а числа тромбоцитов менее 50 Х 10^9 /л рекомендуется временно снизить дозу препарата в 2 раза и повторить анализ через 1 — 2 недели; при сохранении изменений терапию рекомендовано отменить.

За пациентом следует установить тщательное наблюдение при появлении признаков нарушения функционального состояния печени. Использование препарата следует прекратить при прогрессировании симптомов.

При развитии реакций повышенной чувствительности (ангионевротический отек, крапивница, анафилаксия, бронхоспазм) препарат отменяют и немедленно назначают соответствующее медикаментозное лечение.

Необходимо тщательно контролировать функциональное состояние почек при наличии легкого и умеренного нарушения функции почек.

При длительном использовании препарата возможно развитие пневмоний и пневмонитов. Купированию легочных синдромов способствуют своевременная отмена препарата и назначение глюкокортикостероидов.

При появлении изменений со стороны центральной нервной системы или/и психики, включая депрессию, необходимо наблюдение психиатра во время лечения и в течение полугода после его окончания. После прекращения лечения данные расстройства обычно быстро обратимы, но иногда для их полного обратного развития необходимо до 3 недель. Рекомендуется обеспечить консультацию психиатра и прекратить терапию препаратом, если появляются агрессивное поведение, направленное на других людей, или суицидальные мысли, симптомы расстройства психики ухудшаются или не регрессируют. Суицидальные мысли и попытки чаще отмечаются у пациентов детского и подросткового возраста, чем у взрослых. Если лечение с применением препарата признано необходимым у взрослых больных с серьезными нарушениями психики (включая в анамнезе), то его следует начинать, только если проводится лечение психического нарушения и соответствующий индивидуальный скрининг. Применение препарата у пациентов до 18 лет с серьезными нарушениями психики (включая в анамнезе) противопоказано.

У больных с патологией щитовидной железы до начала терапии необходимо определить уровень тиреотропного гормона, в дальнейшем контролировать его содержание следует не реже 1 раза в 6 месяцев, а также при появлении признаков нарушения функции щитовидной железы. Применение препарата у таких пациентов следует проводить под контролем эндокринолога. При появлении нарушений функции щитовидной железы или ухудшения течения имеющихся заболеваний, которые не поддаются лечению, необходимо отменить препарат.

При продолжительном использовании препарата возможны нарушения со стороны органа зрения. Рекомендуется провести офтальмологическое обследование до начала лечения. При любых жалобах со стороны органа зрения необходима немедленная консультация офтальмолога. Больным с заболеваниями, при которых могут происходить изменения в сетчатке (артериальная гипертензия, сахарный диабет и другие), необходимо проходить офтальмологический осмотр не реже 1 раза в полгода. При усугублении или появлении зрительных расстройств необходимо рассмотреть вопрос об отмене терапии.

Больным с прогрессирующими онкологическими заболеваниями или/и патологией сердечно-сосудистой системы необходимо тщательное наблюдение и контроль электрокардиограммы. При появлении артериальной гипотензии следует обеспечить соответствующее лечение и адекватную гидратацию.

У пациентов пожилого возраста, которые получают препарат в высоких дозах, возможны кома, нарушения сознания, энцефалопатии, судороги. При развитии этих нарушений и неэффективности снижения дозы, терапию отменяют.

При продолжительном использовании препарата у некоторых пациентов могут появляться антитела к интерферону. Обычно титры антител невысоки, их появление не снижает эффективность лечения.

У пациентов после трансплантации медикаментозная иммуносупрессия может быть менее эффективной, так как интерферон стимулирует иммунную систему.

С осторожностью назначают больным с предрасположенностью к аутоиммунным заболеваниям. При развитии симптомов аутоиммунного заболевания необходимо провести тщательное обследование и оценить возможность продолжения лечения интерфероном. Иногда лечение препаратом связано с обострением или возникновением псориаза, саркоидоза.

Во время лечения следует соблюдать осторожность при занятии потенциально опасными видами деятельности, где необходимы повышенное внимание и быстрота психомоторных реакций, (включая управление автотранспортом) а при развитии усталости, сонливости, дезориентации или прочих побочных реакций необходимо отказаться от такой деятельности.

Противопоказания к применению

Гиперчувствительность, тяжелые заболевания сердечно-сосудистой системы (недавно перенесенный инфаркт миокарда, сердечная недостаточность в стадии декомпенсации, выраженные нарушения сердечного ритма), тяжелые аллергические заболевания, тяжелая печеночная или/ почечная недостаточность, аутоиммунный гепатит, хронический гепатит с декомпенсированным циррозом печени, психические заболевания и расстройства у детей и подростков, эпилепсия и прочие нарушения функции центральной нервной системы, аутоиммунные заболевания в анамнезе, использование иммунодепрессантов после трансплантации, патология щитовидной железы, которая не поддается контролю общепринятыми терапевтическими методами; беременность, период грудного вскармливания, использование у мужчин, партнерши которых беременны.

Ограничения к применению

Выраженная миелосупрессия, печеночная и/или почечная недостаточность, заболевания щитовидной железы, псориаз, саркоидоз, хронические обструктивные болезни легких, сахарный диабет, склонность к кетоацидозу, нарушения свертываемости крови, психические нарушения, в особенности выражающиеся депрессией, суицидальными мыслями и попытками в анамнезе.

Применение при беременности и кормлении грудью

Использование препарата противопоказано при беременности и кормлении грудью.

Побочные действия интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного

Сердечно-сосудистая система и кровь: преходящая обратимая кардиомиопатия, аритмии, артериальная гипотензия, инфаркт миокарда, лейкопения, лимфопения, тромбоцитопения, анемия.

Пищеварительная система: сухость во рту, боли в животе, тошнота, диспепсия, снижение массы тела, нарушения аппетита, диарея, рвота, панкреатит, гепатотоксичность, повышение активности аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы.

Нервная система и органы чувств: раздражительность, депрессия, нервозность, астения, беспокойство, бессонница, нарушение способности к концентрации внимания, агрессивность, суицидальные мысли, нейропатии, психоз, нарушение слуха, отек конъюнктивы нижнего свода, гиперемия и единичные фолликулы слизистой оболочки глаза, очаговые изменения глазного дна, снижение остроты зрения, неврит зрительного нерва, кровоизлияния в сетчатку, тромбоз артерий и вен сетчатки, отек диска зрительного нерва.

Кожные покровы: повышенное потоотделение, сыпь, зуд, выпадение волос, местная воспалительная реакция.

Эндокринная система: изменения со стороны щитовидной железы, сахарный диабет.

Костно-мышечная система: рабдомиолиз, боль в спине, судороги в ногах, миозит, миалгии.

Дыхательная система: фарингит, диспноэ, кашель, пневмония.

Мочевыделительная система: почечная недостаточность, повышение концентрации креатинина, мочевины.

Иммунная система: аутоиммунная патология (ревматоидный артрит, васкулит, волчаночноподобный синдром), саркоидоз, анафилаксия, ангионевротический аллергический отек, отек лица.

Прочие: гриппоподобный синдром (повышение температуры, озноб, астения, утомляемость, усталость, артралгии, миалгии, головные боли).

Взаимодействие интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного с другими веществами

Препарат снижает клиренс и в 2 раза увеличивает концентрацию аминофиллина в плазме.

При совместном использовании с амфотерицином B возрастает риск развития поражения почек, гипотензии, бронхоспазма; с бусульфаном — веноокклюзионной болезни печени; с дакарбазином — гепатотоксичности; с зидовудином — нейтропении.

Препарат усиливает токсичность доксорубицина.

При совместном использовании с левотироксином натрия изменяет эффект, может потребоваться коррекция дозы.

При совместном использовании с пэгаспаргазой взаимно возрастает риск развития побочных эффектов.

Препарат может снижать активность изоферментов цитохрома Р-450 и, тем самым, влиять на метаболизм фенитоина, циметидина, курантила, диазепама, варфарина, теофиллина, пропранолола, некоторых цитостатиков.

Может усилить миелотоксическое, нейротоксическое, кардиотоксическое действие препаратов, которые назначались ранее или совместно.

Избегать одновременного использования с препаратами, которые угнетают центральную нервную систему, иммуносупрессивными средствами (включая глюкокортикостероиды).

Не рекомендуется употребление алкоголя во время терапии.

При совместном использовании гидроксимочевиной может повышаться частота развития кожного васкулита.

При совместном использовании с теофиллином необходимо контролировать концентрацию теофиллина в плазме крови и при необходимости корректировать режим дозирования.

Передозировка

При передозировке препаратом усиливаются побочные эффекты. Необходима отмена препарата, проведение симптоматического и поддерживающего лечения.

Торговые названия препаратов с действующим веществом интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный

Интерферон альфа-2 человеческий рекомбинантный

Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный

Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный (рчИФН-а2b)

Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный + Дифенгидрамин: Офтальмоферон®.

Фармгруппа:

Отзывы и комментарии

ГМО — есть ГМО, со всеми его

П'тр Вс, 25/10/:40

ГМО — есть ГМО, со всеми его последствиями.

сплошная побочка:потливость

наталья Вс, 13/12/:00

сплошная побочка:потливость озноб раздражительность вплоть до агрессии;кашель диарея даже кошмары по ночам гадость а не препарат будьте осторожнее так и помереть можно

в советское время выпускали

иван Втр, 27/09/:01

в советское время выпускали интерферон который прекрасно лечил и был недорогим и эффективным. не нужно изобретать велосипед.

У меня были побочные эффекты:

ксения Ср, 23/11/:20

У меня были побочные эффекты: сыпь на на лице, отек ног и . груди. За время приема интерферона грудь увеличилась на 1,5 размера.

Источник: http://xn——8kceunaflgjrqyoqfbei8dxl.xn--p1ai/%D0%B8%D0%BD%D1%82%D0%B5%D1%80%D1%84%D0%B5%D1%80%D0%BE%D0%BD_%D0%B0%D0%BB%D1%8C%D1%84%D0%B0-2b_%D1%87%D0%B5%D0%BB%D0%BE%D0%B2%D0%B5%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%80%D0%B5%D0%BA%D0%BE%D0%BC%D0%B1%D0%B8%D0%BD%D0%B0%D0%BD%D1%82%D0%BD%D1%8B%D0%B9